ライゲーション計算機

カテゴリー：生物学

- 2025年4月4日

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ベクターDNA

ベクターの長さ (bp):

ベクター濃度 (ng/μL):

反応中のベクター体積 (μL):

インサートDNA

インサートの長さ (bp):

インサート濃度 (ng/μL):

ベクター:インサートのモル比:

総反応体積 (μL):

ライゲーション反応の設定

推奨インサート量

50.0 ng

2.00 μL の挿入ストック

ベクター量

50.0 ng

使用 1.0 μL のベクターストック

インサート:ベクター比

1:3 (モル比)

標準的なクローニングに最適

完全な反応設定

成分	体積 (μL)	最終量
ベクターDNA (50 ng/μL)	1.0	50.0 ng
インサートDNA (25 ng/μL)	2.00	50.0 ng
T4 DNA リガーゼ	2.0	400 U
T4 DNAリガーゼ	1.0	400 U
ヌクレアーゼフリー水	14.00	20 μLに調整
総体積	20.0

最適化のヒント

入力パラメータに基づいて、いくつかの推奨事項を示します:

1:3から1:5のベクター:挿入比は、標準的なクローン作成アプリケーションに最適です。
16°CはT4 DNAリガーゼの標準温度で、酵素活性と二重鎖の安定性の良いバランスを提供します。
選択したリガーション時間 (4 時間) は、ほとんどの標準的なクローン作成アプリケーションに適しているはずです。
5' スティッキーエンドのベクター:挿入比に対して、16°Cで4 時間の間インキュベートすることが効果的です。
CIPによるベクターの処理は、自己リガーションのバックグラウンドを減少させるのに役立ちます。
CIPは非常に効果的ですが、完全に熱不活化するのが難しい場合があります。問題が発生した場合はフェノール抽出を検討してください。
標準のT4 DNAリガーゼは、適切なインキュベーション時間でほとんどのアプリケーションに適しています。
最良の結果を得るために、変換前にリガーゼを65°Cで10分間熱不活化してください。

DNAライゲーションについて

DNAライゲーションは、ホスホジエステル結合の形成を通じてDNA断片を結合することを含みます。
T4 DNAリガーゼは、適切に機能するためにATPとMg²⁺を必要とします（ライゲーションバッファーに含まれています）。
スティッキーエンドライゲーションは、ブランテンドライゲーションよりも効率的です。
ベクター:インサートのモル比は、標準的なクローニングの場合、通常1:3から1:5の範囲です。
ブランテンドライゲーションや大きなインサートの場合は、より高いインサート:ベクター比（3:1から10:1）が推奨されます。
ベクターの脱リン酸化（CIP、SAPなどを使用）は、ベクターの自己ライゲーションを防ぎます。
クイックリガーゼシステムは、室温でのライゲーション時間を5-15分に短縮できます。

挿入量（ng）の計算式：

$挿入 ng = (\frac{ベクター ng \times 挿入サイズ（kb）}{ベクターサイズ（kb）}) \times (\frac{挿入モル}{ベクターモル})$

ライゲーション計算機とは何ですか？

ライゲーション計算機は、研究者が成功したライゲーション反応に必要なベクターと挿入DNAの適切な量を決定するのを助けるツールです。DNAライゲーションは、DNA挿入がDNAリガーゼと呼ばれる酵素を使用してプラスミドベクターに結合される分子クローニングの重要なステップです。

どのように機能しますか？

この計算機は、ユーザーがベクターと挿入に関する詳細（長さと濃度）を入力できるようにします。選択したモル比に基づいて、最適なライゲーション反応を達成するために必要な挿入DNAの量を計算します。

主な機能

さまざまなクローニングシナリオのためのベクター対挿入のモル比を計算します。
標準およびカスタムのモル比の両方をサポートします。
粘着端または平端クローニングに基づいてライゲーション条件の推奨を提供します。
ライゲーション効率を改善するための最適化のヒントを含みます。

計算機の使用方法

ベクターの長さ（bp）と濃度（ng/μL）を入力します。
挿入の長さ（bp）と濃度（ng/μL）を入力します。
希望するベクター対挿入のモル比を選択します（例：1:3、1:5）。
総反応量（例：20 μL）を指定します。
高度な設定では、ライゲーション温度、時間、リガーゼの種類、ベクター処理オプションを選択します。
「計算」をクリックして、推奨される挿入量と反応設定を生成します。

よくある質問

最適なベクター対挿入のモル比は何ですか？

粘着端ライゲーションの場合、一般的に1:3または1:5のベクター対挿入比が推奨されます。平端ライゲーションの場合は、より高い比率（例：1:5から1:10）が効率を改善する可能性があります。

なぜベクターの脱リン酸化が推奨されるのですか？

脱リン酸化（CIP、SAP、または南極ホスファターゼを使用）は、ベクターの自己ライゲーションを防ぎ、不要なバックグラウンドコロニーを減少させます。

どのライゲーション条件を使用すべきですか？

16°Cで4時間 – T4 DNAリガーゼの標準条件。
室温で15分 – クイックリガーゼに適しています。
16°Cで一晩 – 難しいライゲーションや平端クローニングに推奨されます。

ライゲーション効率を改善するにはどうすればよいですか？

ベクターと挿入の正しいモル比を確保します。
新鮮なDNAリガーゼとバッファーを使用します。
ライゲーション条件（温度と時間）を最適化します。
ライゲーション前にゲル電気泳動で挿入の存在を確認します。

なぜこの計算機を使用するのですか？

このライゲーション計算機は、DNAライゲーション反応の設定を簡素化し、研究者が効率的なクローニングのために適切なベクターと挿入の量を決定するのを助けます。計算を自動化し、最適化のヒントを提供することで、時間を節約し、ライゲーション実験の成功率を高めます。